繼「中中」「華華」後，近日又一波克隆猴成為萬眾矚目的焦點。不同的是，它們是五隻BMAL1基因被敲除的克隆猴。
24日，《國家科學評論》線上發表了這一最新研究成果：中科院神經科學研究所「三劍客」（研究員孫強、劉真、張洪鈞）經過兩年努力，利用CRISPR/Cas9技術，成功構建了世界首批核心節律基因BMAL1敲除獼猴模型，仔細驗證後發現，敲除猴模型存在晝夜節律紊亂，並表現出類似精神分裂的症狀。
獼猴，節律研究的理想動物模型
雄雞報曉，蜘蛛半夜結網，向日葵在清晨開放…….
從簡單的單細胞生物，到複雜的哺乳動物，自然界中大部分生物，都擁有按時間節奏調節自身活動的本領，即生物節律。
生物節律系統在維持機體內在的生理功能（如睡眠/覺醒系統、體溫、代謝和器官功能等），適應環境的變化等方面扮演著重要角色。有關研究表明，生物節律紊亂與代謝綜合症、自身免疫、神經退行性疾病和癌症等疾病密切相關。
然而，多數節律研究用的小鼠等動物模型，因其與人的晝夜活動週期、腦結構和代謝速率等存在明顯差異，由此造成的結果是：藥物研發人員在小鼠模型上花費大量人力物力財力，篩選到的候選藥物用在病人身上，大都無效，或有不可接受的副作用。這極大地制約了生物節律紊亂機理研究和相關疾病治療手段的研發。
在此背景下，與人類最接近的非人靈長類動物，成為科學家們夢寐以求的實驗物件。
「獼猴除了具有晝行性這一特性，在腦結構和功能上與人類高度相似，可以用來研究腦疾病和高階認知功能。」中科院院士、中科院神經科學研究所所長、腦智卓越中心主任蒲慕明說。
據世界衛生組織調查，過去十多年，全球各類疾病給社會造成的負擔中，腦疾病佔28%，已超過心血管疾病和腫瘤。
然而，時至今日，腦疾病的致病機理仍不清楚，尚缺乏特異的藥物靶點。而且，相關神經性藥物研發動輒需要十多年，耗資數十億美元，失敗率卻大於90%。
為何？常用藥物研發動物模型——小鼠，與人類相差甚遠，是個重要原因。
「小鼠的遺傳背景與人類相差較遠，在此基礎上研發的藥物，百分之九十以上對人類沒用。」蒲慕明解釋。
向著科學的高峰努力奔跑，2018年，兩隻名為「中中」和「華華」的克隆猴誕生。從此，拔根汗毛吹口氣就能變出一堆小猴子的神話變為了現實。
「按照傳統方法，培養一批可用於藥物研發的猴子常常需要花費五六年，體細胞克隆猴的實現，彌補了獼猴繁殖週期長、單胎數量少的不足，可以構建出足夠數目的具有統一遺傳背景的動物模型。」蒲慕明表示。
在科學家們看來，「中華」兩姐妹的橫空出世，標誌著非人靈長類克隆時代的到來。
克隆猴，最大意義在於批次製造基因編輯猴
「中中」「華華」的誕生，僅是萬里長征走完了第一步。
蒲慕明說，克隆猴的最大意義之一在於，可以由此批次製造經過基因編輯的猴子，從而為醫療界相關藥物研發提供更優質的疾病模型。
不過，「中中」和「華華」都是野生猴子，使用的細胞來自於流產猴胚胎，從應用價值上來說，不如基因修飾的猴子那麼大。
瞄準基因修飾猴，發起進攻，早在2015年底，神經所科研團隊就利用CRISPR/Cas9技術，敲除了生物節律核心基因BMAL1，產生了一批BMAL1缺失的獼猴。
結果如何？這些猴子有沒有表現出預想的節律紊亂症狀呢？
答案是肯定的。
等到半年後小猴斷奶，研究人員從多個方面開始觀察敲除猴的生物節律。他們給猴子們佩戴了「小米手環」，以便隨時監測到它們的晝夜活動情況，發現敲除猴不再按照24小時的週期活動，在夜間活動明顯增多。
這意味著什麼？敲除猴出現了失眠的問題。
不僅如此，他們還有如下異常表現：
比如，快速眼動睡眠（REM，淺睡期）和慢波睡眠（NREM，熟睡期）明顯減少；
幫助進入睡眠的褪黑素分泌較少；
當保育員靠近敲除猴時，它會雙手抱住頭部，蜷縮在角落裡，不敢活動；
如果將敲除猴放入一個新環境中，它也不能很快地適應，不敢像正常猴那樣在環境中自由探索。
這僅僅是偶然嗎？研究人員又給猴子們做了一個經典的聽覺刺激實驗。
在給出的一連串規律的聲音中隨機插入特殊的聲音，記錄猴子聽到聲音時的腦電圖，研究人員發現：敲除猴大腦在識別和反應這些特殊事件的能力上不如正常猴，這與精神分裂患者的情況類似。
而相關的實驗資料亦說明了同樣的問題。比如，研究人員發現與壓力應激相關的皮質醇，在敲除猴的血液中一直處於高水平。
「行為學分析表明這些獼猴具有晝夜活動紊亂、睡眠障礙、焦慮和精神分裂症等表型。」張洪鈞告訴記者，血液分析也表明其與炎症、睡眠障礙、抑鬱等相關的基因表達水平顯著上調，這為模擬人的節律紊亂相關疾病邁出了關鍵的一步。
如此大費周章構建基因敲除猴為哪般？其實，研究者最期望的就是在這些猴身上找到類似節律紊亂患者的症狀，而這才是非人靈長類較之小鼠等實驗動物的真正優勢。
先前的很多研究表明節律紊亂或睡眠障礙還是一些精神疾病，如，雙向情感障礙、抑鬱症、自閉症譜系障礙的早期症狀。但是，很難認定一隻小鼠有抑鬱或是雙向情感障礙之類的問題。
「從本次的研究可以看到，猴子表現出怕人，避免與人對視等症狀，是以前在小鼠身上很難觀察到的。」張洪鈞說。
成功克隆基因敲除猴
敲除猴的異常表現，讓張洪鈞等人興奮不已。
如果克隆基因敲除猴，由此誕生的克隆猴，其表現是否一如既往？
像克隆「中中」「華華」那樣，這一次，研究團隊選中了睡眠紊亂最明顯的BMAL1敲除獼猴的體細胞，透過體細胞克隆技術，獲得了五隻BMAL1基因敲除的克隆猴。
這是國際上首次成功構建一批遺傳背景一致的生物節律紊亂獼猴模型。
聽起來似乎很簡單，不過是重複「中中」「華華」的克隆方法，沒啥技術含量。其實不然。
根據劉真的說法，克隆的成功率與作為核供體的細胞有很大的關係。但細胞和人一樣會在生長繁殖的過程中逐漸衰老，隨著細胞不斷分裂，其中會積累越來越多的DNA突變，細胞質量也會逐漸下降。
劉真介紹，「中中」「華華」 所用到的胎猴體細胞，本身就來自尚未出生的小猴，十分年輕，自然活力強。但是，實際製作基因編輯猴所用的細胞比這要「年老」很多，更何況基因編輯本身還會對細胞的DNA造成一些損傷。
經過這麼一番折騰後，克隆的成功率會跌到多少？劉真心裡也沒底。
要知道，「中中」、「華華」的克隆成功率較低。「克隆猴成本高昂，如果由此構建經過基因編輯後的克隆猴的成功率太低，很可能就會因為成本問題而讓這項技術長期停留在紙面上。」如果失敗會將怎樣，劉真不敢想像。
幸運的是，他們成功了。
經過兩年努力，研究團隊利用CRISPR/Cas9技術和克隆技術，成功構建了世界首批核心節律基因BMAL1敲除克隆猴模型。
一次製備5只基因敲除的克隆猴，這在很大程度上打消了人們對克隆效率的擔憂。
而從結果來看，本次實驗的基因敲除非常成功。
「這項研究首次證實透過體細胞核移植技術可以克隆成年基因修飾猴。這為（在短期內）生產一批無嵌合體的基因修飾猴提供了一個完美的解決方案。這樣的克隆猴（模型）對人類疾病研究有重要價值……」；
「這是一個新穎的模型，對疾病醫療手段研發極為有用……」；
「利用（體細胞）克隆技術獲得遺傳背景一致的猴模型將會加速對疾病發病機理及治療靶點（篩查）的研究程序……」
隨著研究成果發表，國際同行的讚譽接踵而至。
在專家們看來，該成果表明中國正式開啟了批次化、標準化建立疾病克隆猴模型的新時代，為腦認知功能研究、重大疾病早期診斷與干預、藥物研發等提供新型高效的動物模型；該成果的應用有助於縮短藥物研發週期，提高藥物研發效率，必將極大地促進生命科學和醫學的發展，加快中國新藥創制與研發的程序。
「效率是應用的關鍵，因為研究專案時間較緊，這一次僅獲得了五隻BMAL1基因敲除的克隆猴，如何進一步提升效率，一次性『複製』出更多隻，這將是研究團隊下一步攻關的重點。」蒲慕明表示。
